Inmunofluorescencia directa

Que es directo inmunofluorescencia?

La inmunofluorescencia directa (DIF) es una técnica utilizada en el laboratorio para diagnosticar enfermedades de la piel, los riñones y otros sistemas orgánicos. También se llama prueba fluorescente inmunitaria directa o primario inmunofluorescencia.

DIF implica la aplicación de anticuerpo–fluoróforo conjugado moléculas a muestras de tejido de pacientes obtenidas de biopsias. Estos anticuerpos-fluoróforo conjuga objetivo anormal deposiciones de proteinas en el tejido del paciente. Cuando se expone a la luz, el fluoróforo emite su propia frecuencia de luz, visto con un microscopio. El patrón de tinción particular y el tipo de anomalía proteína declaración que se ven en la muestra de tejido ayudan a diagnosticar la enfermedad.

Inmunofluorescencia directa para el diagnóstico de enfermedades cutáneas

DIF es útil en el diagnóstico de sospecha autoinmune enfermedad, tejido conectivo enfermedades y vasculitis. Los patrones de tinción observados en las muestras de tejido pueden ser específicos de una entidad patológica o pueden necesitar ser interpretados con la clínica y histológico recomendaciones.

Autoinmune bulloso enfermedades

DIF es útil para diagnosticar las siguientes enfermedades ampollosas autoinmunes:

• Pemphigus vulgaris
• Pénfigo foliáceo
• Paraneoplásico pénfigo
• Inmunoglobulina (Ig) Un pénfigo
• Penfigoide ampolloso
• Penfigoide gestacional
• Mucoso penfigoide de membranacicatricial penfigoide)
• Epidermólisis ampollosa adquirida
• Bulloso sistémico lupus eritematoso (LES)
• Lineal Enfermedad bullosa por IgA
• Dermatitis herpetiformis.

Enfermedades del tejido conectivo

DIF es útil para diagnosticar las siguientes enfermedades del tejido conectivo:

• Lupus eritematoso (sistémico, discoidoy subagudo cutáneo formas)
• Neonatal lupus eritematoso
• Sistémico esclerosis
• Enfermedad mixta del tejido conectivo
• Dermatomiositis.

Vasculitis y otras afecciones

La DIF es útil para diagnosticar vasculitis cutánea y algunos otros tipos de inflamatorio enfermedad de la piel:

• Embarcación pequeña (hipersensibilidad) vasculitis
• Henoch – Schönlein púrpura
• Liquen plano
• Porfiria cutánea tarda
• Algunas reacciones cutáneas adversas a los medicamentos
• Fotosensibilidad erupciones

Sitio de biopsia

El sitio óptimo para tomar una biopsia de piel depende de la sospecha de enfermedad.

• Enfermedades ampollosas autoinmunes: toma apariencia normal perilesional piel a menos de 1 cm de una bula. Como pueden surgir resultados falsos negativos de muestras de las extremidades inferiores, evite estos sitios si es posible.
• Enfermedades del tejido conectivo: la biopsia debe tomarse de un lesión (a menudo en áreas expuestas al sol), idealmente que tenga más de 6 meses pero aún esté activo. A menudo se toma una muestra adicional en un sitio protegido del sol.
• Vasculitis: para obtener mejores resultados, tome un biopsia por punción o un profundobiopsia de afeitado de una lesión que tiene menos de 24 horas.

Por lo general, se toma otra biopsia para la hematoxilina-eosina (H&E) de rutina. histología. Tenga en cuenta que el sitio de biopsia óptimo y el período de tiempo requerido difieren para estos ejemplos.

• Enfermedades ampollosas autoinmunes: eliminar un vesícula o biopsia del borde de una bulla.
• Vasculitis: seleccione un purpúrico lesión de menos de 72 horas de duración.

Transporte y almacenamiento de la muestra de biopsia

Las muestras para DIF no deben colocarse en formalina, ya que esto altera las proteínas y disminuye significativamente la precisión de los resultados. Transporte la muestra al laboratorio lo antes posible. Las opciones para transportar la muestra incluyen:

• Colocado en un salina-gasa empapada
• En solución salina solución
• En medios especiales (por ejemplo, Michel o Zeus media)
• Congelado en nitrógeno líquido (no se debe permitir que la muestra se descongele).

Cada laboratorio tiene sus propios protocolos. Las muestras en solución salina pueden producir superior sensibilidad sobre otros medios si se procesa dentro de 24 a 48 horas.

¿Qué sucede con la muestra en el laboratorio?

El DIF puede realizarse en una máquina automatizada o manualmente. El proceso implica primero hacer cortes congelados y luego llevar a cabo inmunofluorescencia.

Preparar secciones congeladas

1. Una biopsia por punción se transporta al laboratorio en una gasa empapada en solución salina.
2. La muestra se coloca en un gel.
3. Se utiliza nitrógeno líquido para congelar la muestra y el gel.
4. La muestra congelada está contenida dentro del gel congelado.
5. La muestra se puede almacenar en nitrógeno líquido durante aproximadamente una semana.
6. Se cortan rodajas de 4-6 micrones de grosor.

Realización de inmunofluorescencia directa

1. Se hacen cinco o seis diapositivas; cada uno por un diferente reactivo. Se utilizará un portaobjetos para una tinción H&E normal.
2. Se usa un bolígrafo especial para dibujar un perímetro para mantener reactivos dentro de las diapositivas.
3. Los portaobjetos se lavan.
4. Los reactivos están compuestos.
5. Los reactivos (conjugados anticuerpo-fluoróforo a IgG, IgM, IgA, complemento proteína C3, y cuando sea necesario fibrinógeno) se dejan caer sobre los portaobjetos y los portaobjetos se dejan durante algún tiempo en la oscuridad.
6. Los portaobjetos se lavan de nuevo en solución.
7. Se colocan cubiertas de vidrio sobre los portaobjetos.

Interpretación de inmunofluorescencia directa

Los portaobjetos de inmunofluorescencia preparados son examinados por un patólogo para determinar los sitios primarios de depósito inmunitario (si los hay), las clases de inmunoglobulina u otros depósitos inmunes y los patrones de depósito. Los patrones de tinción se pueden clasificar en cinco grupos:

• Intercelular patrón de tinción de superficie (ICS)
• Lineal membrana basal zona (BMZ) patrón
• Granular Patrón BMZ
• Patrón Shaggy BMZ
• Vascular y otros patrones.

Ejemplos de patrones de tinción

• Patrón de tinción del espacio intercelular (malla de gallinero), pénfigo vulgar.
• Patrón de tinción del espacio intercelular (malla de gallinero), pénfigo foliáceo.
• Deposición lineal de IgG en la zona de la membrana basal, penfigoide bulloso.
• Deposición lineal de IgA en la zona de la membrana basal, IgA lineal ampollosa dermatosis.
• Patrón de tinción vascular en dérmico vasos de IgM.
• Deposición granular de C3 en la zona de la membrana basal

Patrones de tinción de enfermedades cutáneas específicas

Pemphigus vulgaris

• Patrón de ICS IgG (90-100%) o C3

Pénfigo foliáceo

• Patrón de ICS IgG o C3

Pénfigo paraneoplásico

• Patrón de ICS débil
• BMZ IgG lineal o granular o C3
• A veces, liquenoide cambio

Pénfigo IgA

• ICS con IgA

Penfigoide ampolloso

• BMZ lineal con IgG y BMZ lineal con C3

Membrana mucosa penfigoide (penfigoide cicatricial)

• BMZ lineal con IgG, C3 e IgA

Epidermólisis ampollosa adquirida

• BMZ lineal IgG y C3
• A veces, BMZ lineal IgA o IgM

Dermatitis herpetiforme

• BMZ granular con IgA
• A veces, BMZ C3 granular
• En raras ocasiones, BMZ IgG y M3 granulares

Lupus eritematoso

• Lupus eritematoso sistémico
  • Granular BMZ IgG, IgM, IgA, C3
  • Moteado epidérmico núcleos patrón de IgG (10-15%)
• Lupus eritematoso discoide
  • Granular BMZ IgG, IgM
  • Cuerpos citoides IgM e IgA
• Lupus eritematoso cutáneo subagudo
  • Granular BMZ IgG, IgM, C3
  • Epidérmico intracitoplasmático deposición de partículas IgG
  • Cuerpos citoides IgM, IgA

Esclerosis sistemica

• IgM granular de BMZ
• Deposición de núcleos epidérmicos moteados (20%)

Enfermedad mixta del tejido conectivo

• BMZ granular (15%)
• Patrón de núcleos epidérmicos moteados IgG (46-100%)

Dermatomiositis

• Granular IgM, IgG, C3
• Cuerpos citoides IgM, IgA

Reacciones liquenoides (liquen plano, reacciones a fármacos y fotodermatosis)

• Patrón Shaggy BMZ para fibrinógeno
• Cuerpos citoides IgM, IgA

Porfiria cutánea tarda

• Vasos dérmicos: tinción continua densa IgG, IgA, C3
• Granular BMZ C3, IgM
• BMZ lineal IgG, IgA

Vasculitis

• Vasos dérmicos fuertes IgM, IgG, C3, fibrinógeno

Púrpura de Henoch-Schönlein

• Vasos dérmicos fuertes IgA

¿Qué tan confiables son los resultados de inmunofluorescencia directa?

La prueba DIF es moderadamente sensible para detectar una variedad de enfermedades. La sensibilidad para DIF se acerca al 100% para el grupo de enfermedades del pénfigo, y se ha informado que la sensibilidad es del 55 al 96% para el penfigoide ampolloso. Un estudio de diez pacientes con púrpura de Henoch-Schönlein y nueve con lupus eritematoso demostró pruebas DIF positivas en todos los pacientes.

El número de resultados falsos negativos con DIF depende de la calidad de la muestra, el procesamiento de laboratorio y de si el paciente ha recibido tratamiento o no. Las razones de los resultados falsos negativos incluyen:

• Un sitio incorrecto de biopsia
• Falta de epidermis en biopsias y otros errores técnicos
• Almacenamiento prolongado de la muestra antes de su transporte al laboratorio.
• Fotoblanqueo y otros errores de laboratorio
• El paciente está en tratamiento inmunomodulador activo.